最近看见一个新的蛋白组差异蛋白分析的R包，和大家分享。DEqMS是基于Limma开发，在Limma包上做了很多优化来适应蛋白组学数据分析。其中，Limma假设所有基因具有相同的先验方差而在蛋白质组学中，蛋白质丰度估计值的准确性受到label-free和 labeled方法 中量化的多肽/PSM的数量而异。作者认为多肽或PSM对蛋白质的定量更为准确，DEqMS包能够估计由不同数量的PSM/多肽定量的蛋白质的不同先验方差，具有更好的准确性，该R包可用来分析 label-free和 labeled 的蛋白质组数据。

下面我们用作者的一个简单示例给大家演示一下分析过程：

# 安装DEqMS包
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("DEqMS")

作者示例中展示了一个基于 TMT10plex 的蛋白组学数据，用了三种不同miRNA类似物处理A431细胞(人表皮状癌细胞系)( Zhou Y. Et al Oncogene 2017 )，原始MS数据用  MS-GF+ 搜索，用Percolator后处理，并使用1% protein level FDR过滤得到的蛋白矩阵。

miR_Proteintable 数据 下载

大家可以下载上面的蛋白数据，也可以用R下载：

# Pride ID：PXD004163
url <- "ftp://ftp.pride.ebi.ac.uk/pride/data/archive/2016/06/PXD004163/Yan_miR_Protein_table.flatprottable.txt"
download.file(url, destfile = "./miR_Proteintable.txt",method = "auto")

下面我们用miR_Proteintable.txtTMT数据做后续的差异蛋白分析


# 载入library
library(DEqMS)
library(matrixStats)

# 读取数据
df.prot = read.table(
  "miR_Proteintable.txt",
  stringsAsFactors = FALSE,
  header = TRUE,
  quote = "",
  comment.char = "",
  sep = "\t"
)

# 蛋白水平FDR过滤<0.01
## 提取TMT蛋白定量信息
TMT_columns = seq(15, 33, 2)
dat = df.prot[df.prot$miR.FASP_q.value < 0.01, TMT_columns]
rownames(dat) = df.prot[df.prot$miR.FASP_q.value < 0.01, ]$Protein.accession

# 取log2，删除NA
dat.log = log2(dat)
dat.log = na.omit(dat.log)

# 绘制盒状图
boxplot(dat.log, las = 2, main = "TMT10plex data PXD004163")

接下来设计分组，这个采用limma的设置分组的方法：


cond = as.factor(
  c(
    "ctrl",
    "miR191",
    "miR372",
    "miR519",
    "ctrl",
    "miR372",
    "miR519",
    "ctrl",
    "miR191",
    "miR372"
  )
)

# 设计实验
design = model.matrix( ~ 0 + cond)
colnames(design) = gsub("cond", "", colnames(design))

# 定义分组比较
x <- c(
  "miR372-ctrl",
  "miR519-ctrl",
  "miR191-ctrl",
  "miR372-miR519",
  "miR372-miR191",
  "miR519-miR191"
)
contrast =  makeContrasts(contrasts = x, levels = design)

接下来这一步可能相对比较重要了这也是作者R包的思想或者精髓所在，作者先用limma计算了差异，然后作者统计了PSM的信息：


# 采用limma计算，并进行经验贝叶斯修正计算P
fit1 <- lmFit(dat.log, design)
fit2 <- contrasts.fit(fit1, contrasts = contrast)
fit3 <- eBayes(fit2)

# 添加PSM信息
count_columns = seq(16, 34, 2)
psm.count.table = data.frame(count = rowMins(as.matrix(df.prot[, count_columns])),
                             row.names =  df.prot$Protein.accession)
fit3$count = psm.count.table[rownames(fit3$coefficients), "count"]
fit4 = spectraCounteBayes(fit3)

作者用方差和PSM展示数据的真实分布，此处选择PSM<30：


# <= 30 PSMs.
VarianceBoxplot(fit4,
                n = 30,
                main = "TMT10plex dataset PXD004163",
                xlab = "PSM count")


VarianceScatterplot(fit4, main = "TMT10plex dataset PXD004163")

后续绘图和常规火山图类似，此处不在赘述：


library(ggrepel)
# ggplot2绘制火山图

DEqMS.results$log.sca.pval = -log10(DEqMS.results$sca.P.Value)
ggplot(DEqMS.results, aes(x = logFC, y = log.sca.pval)) +
  geom_point(size = 0.5) +
  theme_bw(base_size = 16) + # change theme
  xlab(expression("log2(miR372/ctrl)")) + # x-axis label
  ylab(expression(" -log10(P-value)")) + # y-axis label
  geom_vline(xintercept = c(-1, 1), colour = "red") + # Add fold change cutoffs
  geom_hline(yintercept = 3, colour = "red") + # Add significance cutoffs
  geom_vline(xintercept = 0, colour = "black") + # Add 0 lines
  scale_colour_gradient(low = "black", high = "black", guide = FALSE) +
  geom_text_repel(data = subset(DEqMS.results, abs(logFC) > 1 &
                                  log.sca.pval > 3),
                  aes(logFC, log.sca.pval , label = gene)) # add gene label



fit4$p.value = fit4$sca.p
# limma包自带volcanoplot函数绘制火山图
volcanoplot(
  fit4,
  coef = 1,
  style = "p-value",
  highlight = 20,
  names = rownames(fit4$coefficients)
)

同时作者还同t-test、 ANOVA 和 Limma做了比较，大家可以查看参考资料1获取详细的信息。

参考资料：

1.http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DEqMS/inst/doc/DEqMS-package-vignette.html

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