BWA – Burrows-Wheeler Alignment Tool ，是将测序序列快速、准确的比对到参考基因组上的开源软件。在二代或者三代测序种运用的相对比较多，尤其是其BWA-MEM 算法对illumina的数据效果更好。

BWA通过创建参考序列的“索引”以加快查找速度，如左图： 显示了一个短的Read片段，其中有一个红色片段和一个蓝色片段，我们试图将其与包含许多蓝色和红色片段的基因组对齐。该索引记录了参考基因组中出现红色和蓝色片段（种子序列）给定模式的所有位置。当BWA遇到新的Read时，它将在索引中查找种子序列，并检索一组位置，这些位置是该Read的潜在比对位置，这样可以减少要检查匹配度的位置数，从而加快搜索速度。

目前BWA包含了三种算法：

  • BWA-backtrack: designed for Illumina sequence reads up to 100bp (3-step)
  • BWA-SW:  designed for longer sequences ranging from 70bp to 1Mbp, long-read support and split alignment
  • BWA-MEM: optimized for 70-100bp Illumina reads

BWA首先需要为参考基因组构建FM索引（ index命令）。对齐算法由不同的子命令调用： aln / samse / sampe用于BWA-backtrack ， bwasw用于BWA-SW， mem用于BWA-MEM算法。

常规BWA比对流程就大致可以分为两步：

  • 建立索引
  • 使用 BWA-backtrack 、 BWA-SW 、BWA-MEM（常用）进行比对

常用命令：

bwa index ref.fa

bwa mem ref.fa reads.fq > aln-se.sam

bwa mem ref.fa read1.fq read2.fq > aln-pe.sam

bwa aln ref.fa short_read.fq > aln_sa.sai

bwa samse ref.fa aln_sa.sai short_read.fq > aln-se.sam

bwa sampe ref.fa aln_sa1.sai aln_sa2.sai read1.fq read2.fq > aln-pe.sam

bwa bwasw ref.fa long_read.fq > aln.sam

1）建立索引

需要Ref序列文件，格式如下（标准的fasta文件格式，示例文件chr10.fa ）：


>chr10 AC:CM000672.2 gi:568336…   <-- '>' charachter followed by sequence name
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN             <-- sequence
…

建立索引：bwa index chr10.fa生成如下文件


chr10.fa      <-- Original sequence
chr10.fa.amb  <-- Location of ambiguous (non-ATGC) nucleotides
chr10.fa.ann  <-- Sequence names, lengths
chr10.fa.bwt  <-- BWT suffix array
chr10.fa.pac  <-- Binary encoded sequence
chr10.fa.sa   <-- Suffix array index

2）BWA alignment。此处我们默认使用 bwa mem 演示


Usage: bwa mem [options] <idxbase> <in1.fq> [in2.fq]

Algorithm options:

       -t INT        number of threads [1]
       -k INT        minimum seed length [19]
       -w INT        band width for banded alignment [100]
       -d INT        off-diagonal X-dropoff [100]
       -r FLOAT      look for internal seeds inside a seed longer than {-k} * FLOAT [1.5]
       -y INT        seed occurrence for the 3rd round seeding [20]
       -c INT        skip seeds with more than INT occurrences [500]
       -D FLOAT      drop chains shorter than FLOAT fraction of the longest overlapping chain [0.50]
       -W INT        discard a chain if seeded bases shorter than INT [0]
       -m INT        perform at most INT rounds of mate rescues for each read [50]
       -S            skip mate rescue
       -P            skip pairing; mate rescue performed unless -S also in use
...

以双端测序结果为例：


bwa mem \
-t 2 \
-M \
-R "@RG\tID:reads\tSM:na12878\tPL:illumina" \
-o results/na12878.sam \
ref_data/chr10.fa \
raw_data/na12878_1.fq \
raw_data/na12878_2.fq

-t 2 : BWA 使用两个线程

-M： 使用选项-M，一些 短的剪切体的匹配被标记为次要 alignment (不是主要 alignment ， 会被大多数“旧”工具忽略 ) 。

-R "@RG\tID:reads\tSM:na12878\tPL:illumina" : 添加read group tag (RG), sample name (SM), 和platform (PL) 到比对结果的文件头上. 

-o results/na12878.sam : 输出比对结果

生成的SAM文件（文件头）：


@SQ     SN:chr10        LN:133797422        <-- Reference sequence name (SN) and length (LN)
@RG     ID:reads        SM:na12878          <-- Read group (ID) and sample (SM) information that we provided
@PG ID:bwa PN:bwa VN:0.7.17… CL:bwa mem     <-- Programs and arguments used in processing
  1. Read ID
  2. Flag: 显示比对信息 例如： paired，aligned，等等。可以参考 decode flags.
  3. Reference sequence name
  4. 在参考序列中开始位置
  5. Mapping Quality
  6. CIGAR string: 比对总览信息如： match (M), insertion (I), deletion (D)
  7. RNEXT: 下一个片段比对上的参考序列的编号，没有另外的片段，这里是’*’，同一个片段，用’=’
  8. PNEXT: 下一个片段比对到参考序列上的第一个碱基位置
  9. TLEN: 模板长度，原始DNA或RNA片段的大小
  10. Read Sequence
  11. Read Quality

生成SAM文件后，可以用samtools等软件进行后续的下一步处理。

参考资料：

1.https://github.com/lh3/bwa

2.http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml

3.https://rbatorsky.github.io/intro-to-ngs-bioinformatics/lessons/03_Alignment.html

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