Philosopher也是Nesvilab出品的蛋白组学分析软件，和之前介绍的FragPipe（主要是基于Philosopher和MSFragger等工具集的一个可视化操作界面工具）、MSFragger（主要用来肽段的鉴定）属于同一个家族的产品。

Philosopher作为数据分析的主要工具集包含了fasta下载、PSM、PTM、FDR计算等功能，支持LFQ和Label（TMT、iTRAQ）等

以下是官方教程：

下面主要根据官网TMT详细数据分析流程做一个简单的介绍和分析：

1）创建工作目录


# 后续的所有分析都应该在/yourdata/workspace目录中完成
cd /yourdata/workspace
philosopher workspace --init

2）下载蛋白质fasta数据文件


# 以人为例，下载编号可以在https://www.uniprot.org/proteomes/查到
# 一般我们分析使用reviewed的数据库（人手工核对的数据库）
# 假设后续用的文件为2019-11-04-td-rev-UP000005640.fas
philosopher database --id UP000005640 --reviewed --contam

也可以用 自建的数据库 或者 已经存在的数据库文件。

3）用MSFragger进行搜库


# MSFragger.jar详细文档可以查看https://msfragger.nesvilab.org/来修改配置
# closed_fragger.params文件

# 质谱原始数据可以用msconvert进行转换，可以转换成如mzML文件
java -Xmx32g -jar MSFragger.jar closed_fragger.params 06_CPTAC_TMTS1-NCI7_P_JHUZ_20170509_LUMOS.mzML

4）用PeptideProphet进行肽段鉴定


philosopher peptideprophet --database 2019-11-04-td-rev-UP000005640.fas --ppm --accmass --expectscore --decoyprobs --decoy rev_ --nonparam 06_CPTAC_TMTS1-NCI7_P_JHUZ_20170509_LUMOS.pepXML

最后会生成 *.pep.xml 文件

5） 用ProteinProphet进行蛋白鉴定


# 利用上一步生成的多肽结果信息
philosopher proteinprophet interact-06_CPTAC_TMTS1-NCI7_P_JHUZ_20170509_LUMOS.pep.xml

最后会得到一个*.prot.xml文件

6）数据过滤和FDR计算


# 利用上面两步生成的多肽和蛋白鉴定结果估算FDR
philosopher filter --razor --pepxml interact-06_CPTAC_TMTS1-NCI7_P_JHUZ_20170509_LUMOS.pep.xml --protxml interact.prot.xml

生成的打分结果可以为后续的分析提供参考

7）定量结果分析

对于TMT我们需要准备一个标记和分组对应文件 annotation.txt形如：

126 control_1
127N treated_1
127C control_2
128N treated_2
128C control_3
129N treated_3
129C control_4
130N treated_4
130C control_5
131N treated_5


# 然后执行如下命令
philosopher labelquant --brand tmt --plex 10 --dir .
# 如果是iTRAQ结果，则需要改变--brand参数，使用--brand itraq代替

8）生成报告


# 执行完前7步后，我们用philosopher的report功能生成报告
philosopher report

备注：为了方便以后可能会重新分析可以用 philosopher workspace --backup 备份项目。

简单的介绍就到此为止了，建议初学者或者不懂shell操作的小伙伴可以使用他们实验室的 FragPipe 完全可视化操作。

参考资料：

1.https://github.com/Nesvilab/philosopher/wiki/Step-by-step-TMT-analysis

2.https://github.com/Nesvilab

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