Philosopher也是Nesvilab出品的蛋白组学分析软件,和之前介绍的FragPipe(主要是基于Philosopher
和MSFragger
等工具集的一个可视化操作界面工具)、MSFragger(主要用来肽段的鉴定)属于同一个家族的产品。
Philosopher作为数据分析的主要工具集包含了fasta下载、PSM、PTM、FDR计算等功能,支持LFQ和Label(TMT、iTRAQ)等
以下是官方教程:
- Philosopher基础教程
- 蛋白数据库下载
- 数据分析基础教程
- TMT 数据分析pipeline
- TMT 数据分析详细教程
- 基于Open search的数据分析方法
- 基于Comet的数据分析方法
- PPI(蛋白互作)分析
下面主要根据官网TMT详细数据分析流程做一个简单的介绍和分析:
1)创建工作目录
# 后续的所有分析都应该在/yourdata/workspace目录中完成
cd /yourdata/workspace
philosopher workspace --init
2)下载蛋白质fasta数据文件
# 以人为例,下载编号可以在https://www.uniprot.org/proteomes/查到
# 一般我们分析使用reviewed的数据库(人手工核对的数据库)
# 假设后续用的文件为2019-11-04-td-rev-UP000005640.fas
philosopher database --id UP000005640 --reviewed --contam
也可以用 自建的数据库 或者 已经存在的数据库文件。
3)用MSFragger进行搜库
# MSFragger.jar详细文档可以查看https://msfragger.nesvilab.org/来修改配置
# closed_fragger.params文件
# 质谱原始数据可以用msconvert进行转换,可以转换成如mzML文件
java -Xmx32g -jar MSFragger.jar closed_fragger.params 06_CPTAC_TMTS1-NCI7_P_JHUZ_20170509_LUMOS.mzML
4)用PeptideProphet进行肽段鉴定
philosopher peptideprophet --database 2019-11-04-td-rev-UP000005640.fas --ppm --accmass --expectscore --decoyprobs --decoy rev_ --nonparam 06_CPTAC_TMTS1-NCI7_P_JHUZ_20170509_LUMOS.pepXML
最后会生成 *.pep.xml
文件
5) 用ProteinProphet进行蛋白鉴定
# 利用上一步生成的多肽结果信息
philosopher proteinprophet interact-06_CPTAC_TMTS1-NCI7_P_JHUZ_20170509_LUMOS.pep.xml
最后会得到一个*.prot.xml
文件
6)数据过滤和FDR计算
# 利用上面两步生成的多肽和蛋白鉴定结果估算FDR
philosopher filter --razor --pepxml interact-06_CPTAC_TMTS1-NCI7_P_JHUZ_20170509_LUMOS.pep.xml --protxml interact.prot.xml
生成的打分结果可以为后续的分析提供参考
7)定量结果分析
对于TMT我们需要准备一个标记和分组对应文件 annotation.txt
形如:
126 control_1
127N treated_1
127C control_2
128N treated_2
128C control_3
129N treated_3
129C control_4
130N treated_4
130C control_5
131N treated_5
# 然后执行如下命令
philosopher labelquant --brand tmt --plex 10 --dir .
# 如果是iTRAQ结果,则需要改变--brand参数,使用--brand itraq代替
8)生成报告
# 执行完前7步后,我们用philosopher的report功能生成报告
philosopher report
备注:为了方便以后可能会重新分析可以用 philosopher workspace --backup
备份项目。
简单的介绍就到此为止了,建议初学者或者不懂shell操作的小伙伴可以使用他们实验室的 FragPipe 完全可视化操作。
参考资料:
1.https://github.com/Nesvilab/philosopher/wiki/Step-by-step-TMT-analysis
2.https://github.com/Nesvilab