蛋白质组数据的差异分析-DEP(R 包)

DEP为蛋白质组数据分析提供了一个可靠的分析流程，它需要由原始质谱数据的定量分析软件(如MaxQuant或IsobarQuant)生成的结果文件作为输入(例如txt文件)，包含了数据预处理、数据过滤、缺失值计算、差异分析等功能。

同时提供可视化工具来探索结果，包括heatmap, volcano plot和barplot等。对于在R方面不了解的研究人员，DEP还包含完整的分析工作流和生成报告（基于shiny的可视化操作），非常方便使用。

1）安装（ 需要安装Pandoc，以及用于Windows的Rtools和用于Linux的NetCDF ）

# 通过BiocManager安装
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly=TRUE))
    install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("DEP")

library("DEP")

2）DEP支持交互式分析（目前支持label free分析和TMT数据分析），按照如下方式启动：

# For LFQ analysis
run_app("LFQ")

# For TMT analysis
run_app("TMT")

3）具体分析流程，按照如下方式

3.1 加载测试数据

library("dplyr")

# 测试数据
data <- UbiLength

# 数据过滤，过滤污染物蛋白质和decoy数据
data <- filter(data, Reverse != "+", Potential.contaminant != "+")

3.2 数据预处理

# 重复基于名称处理
data$Gene.names %>% duplicated() %>% any()
# 查看重复的基因
data %>% group_by(Gene.names) %>% summarize(frequency = n()) %>% 
  arrange(desc(frequency)) %>% filter(frequency > 1)

# 确保基因名称唯一
data_unique <- make_unique(data, "Gene.names", "Protein.IDs", delim = ";")

# 验证
data$name %>% duplicated() %>% any()

3.3 生成一个 SummarizedExperiment 对象，方便后续处理

# 生成SummarizedExperiment对象
LFQ_columns <- grep("LFQ.", colnames(data_unique)) # get LFQ column numbers
experimental_design <- UbiLength_ExpDesign
data_se <- make_se(data_unique, LFQ_columns, experimental_design)

LFQ_columns <- grep("LFQ.", colnames(data_unique)) # get LFQ column numbers
data_se_parsed <- make_se_parse(data_unique, LFQ_columns)

# 查看
data_se

## class: SummarizedExperiment 
## dim: 2941 12 
## metadata(0):
## assays(1): ''
## rownames(2941): RBM47 UBA6 ... ATXN2.3 X6RHB9
## rowData names(13): Protein.IDs Majority.protein.IDs ... name ID
## colnames(12): Ubi4_1 Ubi4_2 ... Ubi1_2 Ubi1_3
## colData names(4): label ID condition replicate

3.4 缺失值过滤

# 查看蛋白鉴定数
plot_frequency(data_se)

# 过滤缺失值，至少在一组中全部被鉴定到
data_filt <- filter_missval(data_se, thr = 0)

# 过滤缺失值，至少在一组中少一个（如一组3个，其中2个鉴定到该蛋白）被鉴定到
data_filt2 <- filter_missval(data_se, thr = 1)

plot_numbers(data_filt) # 查看蛋白数量

plot_coverage(data_filt) # 绘制样品间蛋白质鉴定重叠的柱状图

3.5 数据标准化

data_norm <- normalize_vsn(data_filt)
# 绘图
plot_normalization(data_filt, data_norm)

3.6 缺失值填充

# 查看缺失值情况
plot_missval(data_filt)

plot_detect(data_filt) # 缺失值检测，有或没有缺失值的蛋白质的概率密度曲线

# MNAR（非随机缺失）缺失值填充
data_imp <- impute(data_norm, fun = "MinProb", q = 0.01)
data_imp_man <- impute(data_norm, fun = "man", shift = 1.8, scale = 0.3)
data_imp_knn <- impute(data_norm, fun = "knn", rowmax = 0.9)

# 绘图查看填充效果
plot_imputation(data_norm, data_imp)

# 绘图查看knn填充效果
plot_imputation(data_norm, data_imp_knn)

3.7 差异分析

# 每一个样本vs对照
data_diff <- test_diff(data_imp, type = "control", control = "Ctrl")
# 测试所有可能的比较
data_diff_all_contrasts <- test_diff(data_imp, type = "all")
# 手动指定比较分组
data_diff_manual <- test_diff(data_imp, type = "manual", 
                              test = c("Ubi4_vs_Ctrl", "Ubi6_vs_Ctrl"))
# 添加阈值，筛选
dep <- add_rejections(data_diff, alpha = 0.05, lfc = log2(1.5))

3.8 结果可视化

# 主成分分析
plot_pca(dep, x = 1, y = 2, n = 500, point_size = 4)

# 相关性分析
plot_cor(dep, significant = TRUE, lower = 0, upper = 1, pal = "Reds")

# 热图
plot_heatmap(dep, type = "centered", kmeans = TRUE, 
             k = 6, col_limit = 4, show_row_names = FALSE,
             indicate = c("condition", "replicate"))

# 火山图
plot_volcano(dep, contrast = "Ubi6_vs_Ctrl", label_size = 2, add_names = TRUE)

3.9 个性化显示部分感兴趣的基因/蛋白

# 条形图
plot_single(dep, proteins = c("USP15", "IKBKG"))

plot_single(dep, proteins = "USP15", type = "centered")

# 绘制不同条件下显著蛋白的频率图
plot_cond(dep)

至此，蛋白组学的基本分析结束了，后续的分析包括GO/KEGG、IPA等分析下一篇在详细讲解。

参考资料：

1.http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DEP/inst/doc/DEP.html#lfq-based-dep-analysis